ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕНИТАЛЬНОГО ГЕРПЕСА

В работе представлен анализ результатов 4 методов исследования для выявления вируса простого герпеса при урогенитальной вирусной инфекции: полимеразной цепной реакции культурального метода и реакций иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа. Обследовано 25 больных генитальным рецидивирующим герпесом. Культуральная диагностика признана наиболее эффективным методом на всех стадиях инфекционного процесса, а иммуноферментный анализ – наименее эффективным, отмечена также низкая чувствительность полимеразной цепной реакции, данные которой целесообразно подтверждать при постановке или снятии диагноза ВПГ-инфекции дополнительными методами.

Ключевые слова: генитальный герпес, диагностика

Four methods for detection of herpes simplex virus in patients with urogenital viral infection are compared: polymerase chain reaction, cultural method, immunofluorescent test, and enzyme immunoassay. Twenty-five patients with relapsing genital herpes were examined. Cultural diagnosis proved to be the most effective method at all stages of the infectious process, while enzyme immunoassay was the least effective. The sensitivity of polymerase chain reaction was low; the results of this reaction should be verified by accessory methods for the diagnosis of herpes infection.

Key words: genital herpes, diagnosis

Заболевания, вызываемые вирусом простого герпеса (ВПГ) типов 1 и 2, представляют значительную проблему для миллионов людей во всем мире [21]. Уровень заболеваемости генитальным простым герпесом в России увеличился за период 1994−1998 гг. в 1,8 раза: с 1,7 до 13 случаев на 100 000 населения [6]. Проявления инфекции варьируют от болезненных пузырьков на коже или слизистых оболочках до тяжелых поражений центральной нервной системы [21].

В связи с разнообразием клинических проявлений простого генитального герпеса и его частым сочетанием с другими урогенитальными инфекциями важное значение приобретает дифференциальная диагностика заболевания [1]. В настоящее время для лабораторной диагностики ВПГ-инфекции используются следующие методы: полимеразная цепная реакция (ПЦР), культуральный метод и его модификации, реакции иммунофлюоресценции (ИФ) и иммуноферментного анализа (ИФА) [2−5, 7−9, 14].

В практическом здравоохранении применение всего комплекса из четырех методов в большинстве случаев затруднительно. Поэтому актуальным является вопрос о выборе 1−2 методов, обладающих наибольшей специфичностью и чувствительностью.

Цель настоящей работы состояла в сравнительном анализе четырех методов лабораторной диагностики герпесвирусной инфекции на материале от больных, имеющих клинические проявления генитального герпеса. Особое внимание уделяли изучению эффективности сравниваемых методов при использовании их на разных стадиях герпетической инфекции.

Материалы и методы

Забор материала от больных (соскобы эпителиальных клеток уретры) проводили при помощи зондов (производства Швейцарии) и делили на три части: одну часть каждого образца исследовали методом ПЦР с помощью набора ГЕРПОЛ на базе НПФ “ЛИТЕХ” при НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ (Москва); другую – наносили на предметные стекла с последующей фиксацией в холодном ацетоне; третья – помещалась в транспортную среду и впоследствии использовалась для заражения клеток культуры Vero, выращенных на покровных стеклах. Отдельным зондом проводили забор материала для ИФА.

Перевиваемые клетки линии Vero были получены из коллекции клеточных культур НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН и выращивались в среде Игла МЕМ, содержащей 5% сыворотки, эмбрионов коровы, 5% сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Для выявления антигена (АГ) ВПГ использовали 2 метода: 1−й – метод определения АГ непосредственно в мазках эпителиальных клеток слизистой уретры больных; 2−й – быстрый культуральный метод (БКМ), при котором материал, полученный от больных, культивизировали совместно с клетками Vero в течение 24 ч, после чего клетки культуры фиксировали в холодном ацетоне. При обоих методах выявление ВПГ проводили в реакции непрямой иммунофлюоресценции (НИФ). На фиксированные препараты наносили МКА к ВПГ, описанные ранее [7, 13], и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37^оС. Затем промывали проточной водой и наслаивали антивидовой конъюгат – антитела против иммуноглобулинов мыши, меченые ФИТЦ (производство НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи) на 30 мин при температуре 37^оС. Окрашенные препараты исследовали под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ И-1 (С-Петербург).

Положительным результатом считали выявление не менее 5% светящихся клеток в препарате. Препараты плохого качества, т. е. содержащие большое количество слизи или недостаточное количество клеток (менее 25 клеток на стекло), не исследовались.

ИФА проводили при помощи коммерческой тест-системы фирмы Murex “Ampllified enzyme immunoassay for direct detection of Herpes Simplex Virus antigen (Types 1 and 2)”. Забор материала и постановку реакции осуществляли по инструкции, прилагаемой к набору.

Были обследованы 25 больных (13 женщин и 12 мужчин) рецидивирующей герпетической инфекцией гениталий, обратившихся в Городской кожно-венерологический клинический диспансер Комитета здравоохранения Москвы. В стадии обострения взято 24, в стадии эпителизации – 23, в период ремиссии – 19 образцов для исследования.

Контрольную группу составили 9 пациентов (4 женщины и 5 мужчин), у которых в анамнезе герпетических высыпаний не отмечалось (отрицательный контроль), и 5 пациентов (2 женщины и 3 мужчины) с острой герпетической инфекцией (положительный контроль). В группе сравнения все образцы были исследованы на содержание АГ в мазках, БКМ, ПЦР и классическим вирусологическим методом. Для этого в 24 луночных панелях выращивали монослой клеток Vero, заражали исследуемым материалом и наблюдали за развитием типичного для ВПГ цитопатического действия (ЦПД) в культуре в течение 7 дней.

Результаты исследования

Результаты сравнительного исследования клинического материла от одних и тех же больных разными диагностическими методами представлены в табл.1. Данные табл. 1 показывают, что в период обострения герпетической инфекции максимальное количество положительных образцов было выявлено БКМ и при исследовании цитологических препаратов, минимальное количество – методом ИФА. Во время эпителизации БКМ выявил наибольшее количество положительных образцов. Анализ цитологических препаратов и ПЦР обнаружили приблизительно одинаковое количество положительных образцов, значительно меньше удалось выявить в ИФА. В период ремиссии БКМ и ПЦР было выявлено больше положительных образцов, чем при исследовании цитологических препаратов. Сравнивая результаты, можно констатировать, что БКМ оказался наиболее эффективным, а ИФА – наименее эффективным методом при обнаружении ВПГ на всех изучаемых стадиях инфекционного процесса. Следует отметить, что с помощью ПЦР в стадии обострения не была выявлена ДНК ВПГ в 9 образцах, когда БКМ был обнаружен инфекционно активный вирус.

Данные табл. 2 показывают, что наибольшее совпадение результатов, полученных различными методами, было обнаружено в стадии ремиссии, а не в стадии обострения процесса, как можно было предположить.

Дополнительно была исследована контрольная группа. Помимо 3 методов диагностики, использовавшихся ранее, материалы от больных этой группы были изучены “классическим” методом – по ЦПД в культуре. Данные исследования в этой группе представлены в табл. 3. Материалы показывают, что из 9 пациентов, в анамнезе которых отсутствовали герпетические высыпания, ВПГ был обнаружен вирусологическим методом, БКМ и в мазках — у 1, с помощью ПЦР – ещё у 2 человек. У пациентов с симптомами острой инфекции ВПГ был выявлен БКИ, вирусологическим и цитологическим методами во всех 5 изученных случаях (100%), тогда как методом ПЦР – только в 3 (60%).

Для выяснения причин несовпадения результатов ПЦР с результатами других методов были проведены специальные опыты. Сравнивали результаты ПЦР, проведенной стандартным способом, используемым для выделения геномной ДНК ВПГ в образцах, с результатами ПЦР тех же образцов по модифицированному протоколу, включающему выявление ингибиторов реакции и различные способы выделения ДНК. Опыты показали, что возможными причинами отрицательных результатов в ряде случаев могут быть присутствующие в образцах ингибиторы ПЦР, а также разрушение или недостаточно полное выделение ДНК при проведении реакции. С учетом этих факторов удалось повысить выявляемость ДНК ВПГ в стадии обострения до 80%.

Обсуждение

Проведено изучение урогенитальных образцов 4 методами лабораторной диагностики генитального герпеса, которые характеризуют различные маркеры ВПГ: ПЦР – ДНК-геном; ИФА и НИФ мазков – вирусные белки внеклеточные и внутриклеточные соответственно; БКМ – инфекционную активность вируса. Сравнительный анализ показал, что наиболее чувствительным на всех изученных стадиях заболевания является БКМ, наименее чувствительным – ИФА (см. табл. 1). Низкая (39%) чувствительность ИФА при выявлении ВПГ по сравнению с ПЦР и культуральным методом была установлена также в работе M. Slomka и соавт. [27]. Совпадение результатов выявления ВПГ на разных стадиях заболевания у одних и тех же пациентов чаще всего наблюдалось между БКМ и НИФ цитологических препаратов (табл. 2). Согласно данным этих двух методов, можно заключить, что частота выявления инфекционно активного ВПГ и экспрессия вирусных белков в зараженных клетках эпителия урогенитального тракта уменьшаются в среднем в 2−4 раза, что соответствует снижению клинических проявлений патологического процесса. Тем не менее следует отметить, что даже в стадии ремиссии, когда клинические проявления ВПГ-инфекции минимальны или отсутствуют, в урогенитальном тракте 20−40% больных были обнаружены ДНК, белки и инфекционно активный ВПГ. Принципиально сходные данные были получены при изучении динамики ВПГ-инфекции в работе N. Pramod и соавт. [22]. Анализ 234 больных офтальмогерпесом культуральным методом и НИФ выявил ВПГ в течение 1−й недели заболевания у 58% обследованных, тогда как через 4 нед – только у 5%.

Заслуживают специального обсуждения более низкая чувствительность ПЦР и несовпадение результатов ПЦР и других методов, обнаруженные в настоящей работе, особенно при обследовании в стадии обострения ВПГ-инфекции (см. табл. 2, 3). Сходные данные были получены S. Kamei и соавт. [16], которые показали, что в стадии обострения ВПГ в мазках удалось обнаружить в 25% образцов, в которых ДНК ВПГ методом ПЦР выявлена не была. Эти данные противоречат результатам ряда исследователей [12, 20, 23, 27], показавших более высокую чувствительность ПЦР по сравнению с культуральным методом и анализом АГ в мазках методом НИФ. Ценность данных ПЦР-анализа ВПГ снижают расхождение в данных, полученных в разных лабораториях. Так, при двуцентровом исследовании образцов от 43 больных в Швейцарии в 1999 г. [15] было зарегистрировано расхождение данных ПЦР в 19 случаев.

Указываются три основные причины расхождения результатов: неадекватные методы приготовления образцов, присутствие ингибиторов реакции и неполная экстракция ДНК или ее разрушение [15, 18]. По данным настоящей работы, изменение протокола выделения ДКН и удаление ингибиторов реакции позволили повысить частоту выявления ДНК ВПГ в острый период почти в 2 раза (с 46 до 80%) и приблизить ее к частоте выявления с помощью БКМ и НИФ. О том, что ингибиторы реакции могут быть причиной отрицательных результатов ПЦР, сообщили ряд авторов [13, 24, 29]. Показано [29], что ингибиторы значительно чаще обнаруживаются в соскобах уретры (45%), чем в цервикальных соскобах (7%) и в образцах мочи (1,1%). Поскольку в настоящей работе нами были исследованы соскобы уретры, именно присутствие ингибиторов, по-видимому, обусловило низкую выявляемость ВПГ. Аналогичные результаты были получены в работе [15], авторы которой изменили протокол обработки образцов и очистки ДНК, что позволило снизить расхождения в данных ПЦР с 18 до 1,3%. Это означает, что использование ПЦР в учреждениях практического здравоохранения требует стандартизации, контроля и усовершенствования метода, на что направлены усилия многих исследовательских лабораторий и фирм [10−12, 16, 17, 25, 28]. Осторожное отношение диагностических лабораторий к данным ПЦР демонстрирует масштабное исследование, проведенное в Англии [26] в 1999 г. Оно показало, что из 146 клинических лабораторий в 133 (91%) основным методом лабораторной диагностики ВПГ-инфекции был культуральный метод и еще в 13 (9%) – выявление АГ в мазках. По мнению специалистов, будущее за комбинацией 2 лабораторных методов: усовершенствованной ПЦР и культурального (или цитологического).

Что касается этиологического агента генитального герпеса, то, согласно данным ПЦР, полученным в настоящей работе, доля ПЦР, полученным в настоящей работе, доля ВПГ-1 составляла 41%, ВПГ-2 – 18% и сочетанная инфекция ВПГ-1 + ВПГ-2 – 41%. Увеличение частоты встречаемости ВПГ-1 как причины генитального герпеса отмечено и другими авторами [30]. Одной из причин этого явления может быть передача ВПГ путем орогенитальных контактов (W. Lafferty и соавт.) [19].

Заключение

Суммируя результаты работы, можно заключить, что БКМ является высокочувствительным и специфичным и может быть рекомендован как предпочтительный метод лабораторной диагностики для верификации диагноза генитального герпеса на всех стадиях герпетической инфекции. При проведении ПЦР для выявления ДНК ВПГ в урогенитальных соскобах необходимо использовать адекватные методы обработки клинического материала и устранения ингибиторов реакции. В настоящее время результаты ПЦР при постановке или снятии диагноза ВПГ-инфекции требуют подтверждения одним из дополнительных методов лабораторной диагностики.

 

 

Таблица 1

Частота выявления ВПГ на разных стадиях герпесвирусной инфекции

Примечание. В скобках указан процент. * — отношение числа положительных образцов (в %) к числу всех изученных.

 

Таблица 2

Совпадение результатов, полученных разными методами лабораторной диагностики

Примечание. Совпадение результатов: 1 – общее, 2 – положительное, 3 – отрицательное, 4 – расхождение результатов. В скобках указан процент.

 

Таблица 3

Частота выявления ВПГ в контрольной группе пациентов 4 методами лабораторной диагностики

Примечание. В скобках указан процент. * — пояснения в тексте.

 

 

 

ЛИТЕРАТУРА

Предупрежден, значит вооружен

Общий анализ крови: как расшифровать онлайн самый важный анализ еще до похода к врачу

Digene-тест – диагностический тест на ВПЧ. Ранняя диагностика рака шейки матки

Когда и как лечить деменцию?

Почему хочется сбежать из больницы, и есть ли этому альтернатива?