Место ПЦР в диагностике урогенитальных инфекций: взгляд клинициста

В настоящее время в клинической картине многих заболеваний, передающихся половым путем, отмечаются малосимптомность, отсутствие характерных проявлений, наклонность к латентному течению. В связи с этим все большее значение приобретают лабораторные методы их диагностики. Последнее десятилетие характеризуется стремительным внедрением в практическое здравоохранение новых молекулярно-биологических методов исследования на фоне постоянного совершенствования уже ставших традиционными (микробиологические, серологические, иммунохимические). Многие методы требуют высокой квалификации персонала, значительных материальных затрат. В связи с этим в последние годы имеет место благоприятная тенденция к созданию крупных специализированных диагностических центров, предлагающих дерматовенерологической службе весь комплекс современных лабораторных методик на достаточно высоком уровне и в сжатые сроки. Поэтому возрастает ответственность клиницистов при назначении того или иного лабораторного исследования и его интерпретации. В настоящей работе сделана попытка определить место молекулярно-биологических методов исследования (полимеразная цепная реакция) в клинико-лабораторном алгоритме диагностики инфекций, передающихся половым путем.

Хламидийной инфекции свойственны отсутствие патогномоничных клинических симптомов, наклонность к затяжному, рецидивирующему течению, cочетание с другими инфекционными агентами (микоплазмы, уреаплазмы), поэтому установление этиологического диагноза без лабораторного подтверждения представляется невозможным.

Цитоскопический метод диагностики основан на выявлении цитоплазматических клеток-включений Провачека, широко доступен, но эффективен лишь при острых формах заболевания. При урогенитальном хламидиозе частота их обнаружения не превышает 10−12%.

Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) прямое выявление как корпускулярных, так и растворимых антигенов хламидий при люминесцентной микроскопии. Метод является скрининговым и основными показаниями к его применению являются острая, хроническая формы заболевания, необходимость установления хламидийной этиологии инфекционного процесса урогенитального тракта. Его чувствительность и специфичность при использовании моноклональных антител, содержащихся в качественных импортных наборах, могут составлять 60% и 80% соответственно. Методика требует ее исполнения опытным лабораторным работником, высококвалифицированная экспертная оценка методом ПИФ редко бывает доступной, в частности, оценка эффективности лечения. ПИФ недостаточно чувствительна для определения малых количеств элементарных телец — возможны ложноотрицательные результаты.

Методы иммуноферментного анализа (ИФА) основаны на обнаружении растворимого антигена хламидий в цервикальных и уретральных мазках с детекцией результатов исследования на ИФА-анализаторе. Чувствительность и специфичность при использовании качественных импортных тест-систем приближается к 65−70% и 80−90% соответственно. Показания к применению такие же, как и для метода ПИФ.

Более широкие показания имеет ИФА-метод при выявлении антихламидийных антител классов IgM, IgA, IgG в сыворотке крови. Его следует применять при определении стадии заболевания (острая, хроническая, реактивация или реинфекция, состояние после реконвалесценции), оценки эффективности лечения (наряду с культуральным методом и ПЦР), установления хламидийной этиологии экстрагенитальных поражений. Наибольшую диагностическую информацию предоставляет использование тест-систем, выявляющих антитела к антигену C.trachomatis в количественном титре. Титр IgM характеризует острую форму заболевания, титры IgA, IgG — хроническую, реинфекцию или реактивацию, повышенные титры IgG могут являться маркерами перенесенной в прошлом инфекции.

Культуральный метод диагностики основан на выделении возбудителя в культуре клеток, обработанных различными метаболитами. Он является референсным («золотой стандарт»), но наиболее трудоемок и длителен в исполнении (3−7 дней). Культуральный метод обладает наиболее широкими показаниями при диагностике хламидиоза. В отличие от цитоскопического, ПИФ и ИФА-методов его можно использовать при оценке эффективности антибактериальной терапии, выявлении резистентности к антибиотикам, индикации хламидий у иммунодефицитных больных.

Высокие показатели чувствительности и специфичности полимеразной цепной реакции (ПЦР) делают ее революционной в лабораторной диагностике. Основными мишенями при выявлении хламидии являются нуклеотидная последовательность криптической плазмиды, последовательность главного белка внутренней мембраны, рибосомальные гены. Показания к применению ПЦР такие же, как и у культурального метода, за исключением невозможности выявления резистентности к антибиотикам. Следует учитывать, что при исследовании биопроб методом ПЦР сразу после курса антибактериального лечения в некоторых случаях можно получить «ложноположительные с клинической точки зрения» результаты, поскольку невозможно однозначно оценить жизнеспособность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только молекулярно-биологические методы. При исследовании культуральным методом микробные клетки, потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, не дадут роста в клеточной культуре.

На основании изложенного можно предложить клиницистам лабораторный диагностический алгоритм хламидийной инфекции:

Трихомониазу свойственна широта клинических проявлений. Основным носителем инфекции являются женщины детородного возраста. У них возможны как бессимптомное носительство (в 25 — 50% случаев), так и клинически очевидный вагинит.

У мужчин в клинико-эпидемиологическом отношении трихомониаз можно разделить на следующие группы: бессимптомное носительство, острый, контактное выявление по инфицированной половой партнерше. Довольно часто клинические симптомы не отражают реальной картины заболевания, необходимо применение лабораторных методов диагностики. Доказано, что при использовании в диагностическом процессе только одной клинической картины у 88% женщин трихомониаз не будет выявлен, а в 29% случаев неинфицированным женщинам будет поставлен ложноположительный диагноз.

В настоящее время применяют четыре основных лабораторных метода выявления Т.vaginalis: микроскопический, культуральный, иммунологический и молекулярно-биологический (ПЦР).

Микроскопический метод включает в себя следующие методики:

Он имеет самую низкую чувствительность (30%) относительно других методов лабораторной диагностики трихомониаза. Это обусловлено потерей клеткой характерной подвижности после того, как трихомонада уже извлечена из окружающей среды человеческого организма. Особенно затруднительна диагностика в случае низкотитражных препаратов или препаратов, содержащих огромное количество клеток эпителия, лейкоцитов. В очаге воспаления трихомонада часто представлена округлыми формами, напоминающими полиморфоядерные лейкоциты, и естественно, типичные морфологические признаки теряются во время фиксации и окрашивания, создавая трудность для этиологической идентификации.

К культуральным методам выявления T.vaginalis относятся следующие: выращивание трихомонад в бульонной культуре, метод пластикового конверта, метод системы InPouch, рост патогена на клеточной культуре.

В России культуральный метод — это второй основной метод, используемый в лабораторной диагностике трихомониаза и первый по своей значимости до середины 90−х годов. Наибольшую практическую значимость имеет технология роста патогена на клеточной культуре, использующая способность клеточных линий восстанавливать T.vaginalis из клинических образцов. Доказано, что этот метод лучше относительно культивирования в бульоне и приготовления влажной камеры, поскольку способен детектировать T.vaginalis в концентрациях менее 3−х организмов в 1 мл, но он дорог и длителен по времени.

Проведенный в 1990 г. анализ диагносцирования «трихомониаза» в ЦНИКВИ МЗ РФ, показал, что подавляющее число больных трихомониазом (72,8%) как среди женщин, так и среди мужчин были выявлены благодаря применению культурального метода.

Иммунологические методы не получили должного распространения в России вследствие отсутствия качественных отечественных тест-систем. Клиническое значение имеют прямое определение антител T.vaginalis в биопробах с использованием моноклональных антител в качестве быстрого метода диагностики трихомониаза. Моноклональные антитела для выявления T.vaginalis из клинических образцов давали аналогичные результаты с влажными препаратами для микроскопии. Прямой иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализ трихомонад, использующий перокидазо- и флюорохром — меченные смеси моноклональных антител к различным структурам T.vaginalis были такими же чувствительными и специфическими, как и культуральные методы. К тому же эти результаты этим методом достигаются в течение одного часа, что позволяет осуществлять контрольно-диагностическую функции.

В настоящее время ПЦР-технология занимает первое место в клинической лабораторной диагностике трихомониаза наравне с культуральным методом. Данные зарубежных авторов по сравнительным исследованиям биопроб методами микроскопии, культурального посева и ПЦР на наличие T.vaginalis показали, что ПЦР-метод имеет чувствительность 97% и специфичность 98% в сравнении с 70% чувствительности культурального и 36% микроскопического методов. Основными преимуществами ПЦР по сравнению с другими методами являются:

Можно определить следующие показания к выявлению T.vaginalis методом ПЦР:

Основными методами лабораторной диагностики N.gonorhoeae в настояшее время являются микроскопический, культуральный и молекулярно-биологический.

Микроскопический метод выявления N.gonorhoeae имеет низкую чувствительность и ему также присущи недостатки микроскопической диагностики трихомониаза.

Культуральная диагностика N.gonorhoeae имеет недостаточное распространение в дерматовенерологической практике России из-за чрезвычайной прихотливости гонококка к микробиологическим средам и длительности анализа.

ПЦР-диагностика гонореи довольно перспективна и в настоящее время имеет тенденцию к широкому распространению. По данным зарубежных авторов ПЦР-анализ при использовании тест-систем «Amplicor C. trachomatis/ N.gonorhoeae» фирмы «Ф.Хоффманн — Ла Рош» обладает высокой специфичностью и чувствительностью, превосходящей в ряде случаев культуральный метод.

В России по экономическим причинам невозможно широкое применение ПЦР-тест-систем фирмы «Ф.Хоффманн — Ла Рош». В связи с этим клиницист при выборе коммерческой лаборатории должен учитывать риск получения ложноположительных результатов из-за возможного использования в ней низкоспецифичных праймеров, имеющих «перекрест» с непатогенными нейссериями.

Показания к определению N.gonorhoeae методом ПЦР аналогичны показаниям к ПЦР — диагностике трихомониаза.

При заборе биопроб на ПЦР-анализ следует учитывать, что наиболее информативным будет являться исследование мочи, слюны, в меньшей степени уретрального и цервикального мазков. Качественное определение ДНК вируса герпеса I-II типа наиболее эффективно при латентной форме заболевания, отсутствии выраженных клинических проявлений, микст-инфекции. ПЦР-исследованию на герпес в обязательном порядке должны подвергаться беременные, поскольку персистирование вируса герпеса в половых путях даже у серопозитивных лиц резко повышает риск инфицирования плода. При проведении противовирусной терапии определение титров антител класса IgG к герпетическому антигену методом ИФА является показателем эффективности лечения.

 

Gardnerella vaginalis является наиболее значимым этиопатологическим компонентом бактериального вагиноза. В то же время наличие G. vaginalis не всегда сопровождается клинической картиной вагиноза. Частота ее обнаружения у здоровых женщин составляет от 12% до 47% в титре до 10⁶ КОЕ/ мл вагинального отделяемого, и только при определенных условиях, приводящих к изменению соотношения анаэробных и аэробных бактерий, обнаружение G. vaginalis свидетельствует о развитии вагиноза. Он характеризуется резким снижением титра лактобацилл и значительным увеличением количества анаэробных микроорганизмов, концентрация которых достигает 10⁹−10¹¹ КОЕ/ мл вагинального отделяемого. В настоящее время основным методом диагностики бактериального вагиноза является культуральный.

Качественная детекция G. vaginalis методом ПЦР, применяемая во многих коммерческих лабораториях, является малоинформативным исследованием, поскольку ее выявление должно носить количественный или полуколичественный характер.

Не является также клинически значимым факт единичиного выявления G. vaginalis методом ПЦР в уретральном отделяемом у мужчин. Это может свидетельствовать лишь о наличии гарднерелл у полового партнера обследованного.

В настоящее время в ряде лабораторий ведется интенсивная работа по созданию ПЦР-тест-систем с применением высокоспецифичных праймеров, позволяющих определять концентрацию G. vaginalis в клиническом материале.

Период экстенсивного применения качественной детекции ДНК инфекционных агентов, в целом, определил место ПЦР в структуре клинико-лабораторного диагноза ИППП. К сожалению, излишняя коммерциализация ПЦР-анализа и имеющиеся недостатки в работе лабораторий и качестве тест-систем приводят в ряде случаев к дискредитации метода. В связи с этим немаловажное значение приобретает становление и совершенствование системы внешнего и внутреннего контроля качества работы ПЦР-лабораторий.

Несомненно преимущество ПЦР в диагностике таких латентных инфекций, как хламидиоз, герпес, позволяющее исключить применение дорогостоящих и трудоемких культуральных методов.

Сочетанное применение микробиологического метода и ПЦР позволяет выявлять микоплазмы в минимальном количестве, достаточном для развития патологического процесса с определением их антибиотикорезистентности.

Применение ПЦР необходимо при выявлении трихомонад и гонококков в случае латентного течения заболевания, наличия микст-инфекции, проведения контроля эффективности антибактериального лечения (наряду с культуральным методом).

При диагностике бактериального вагиноза ПЦР не имеет в настоящий момент преимуществ перед культуральными методами.

Применение ПЦР при диагностике всех инфекций, передаваемых половым путем, позволяет исключить субъективизм микроскопического исследования.

 

 

Предупрежден, значит вооружен

Общий анализ крови: как расшифровать онлайн самый важный анализ еще до похода к врачу

Digene-тест – диагностический тест на ВПЧ. Ранняя диагностика рака шейки матки

Когда и как лечить деменцию?

Почему хочется сбежать из больницы, и есть ли этому альтернатива?