22 октября 2002 13:13
Особенности клеточного иммунитета у больных красным плоским лишаем и влияние на него иммуномодулятора ликопида
Авторы: Ханухова Л.М., О.Ф. Рабинович,
Н.М. Голубева, К.Ф. Хамидуллина,
С.В. Климова, Б.В. Пинегин.
(ГНЦ — Институт иммунологии Минздрава РФ, ЦНИИ стоматологии Минздрава России, г.Москва)
 |
На ранних этапах заболевания в пораженных участках превалируют Т-клетки CD4+, на поздних -CD8+ [10]. Большую роль в этиопатогенезе КПЛ играют и сами кератиноциты: после активации они продуцируют провоспалительные цитокины в значительно большем количестве, чем мононуклеарные клетки, инфильтрирующие пораженные ткани [21, 22]. В конечном счете КПЛ можно отнести к таким аутоиммунным процессам, в этиопатогенезе которых главная роль принадлежит Тh1−клеткам (воспалительным Т-хелперам CD4+), вызывающим воспалительный процесс типа гиперчувствительности замедленного типа [20]. Как известно, главным
маркерным цитокином этой популяции клеток является гамма-ИФН [12], который, как уже указывалось, в значительной степени опосредует имеющиеся при КПЛ иммунопатологические явления. В связи с этим были предприняты попытки [9, 11] лечить КПЛ с помощью альфа-ИФН, вызывающего хороший клинический эффект при ряде других Thl-опосредованных аутоиммунных заболеваниях — рассеянном склерозе и ревматоидном артрите [1, 15, 19]. Были предприняты попытки успешного лечения КПЛ с помощью некоторых иммуномодуляторов, в частности диэтилдитиокарбамата, повышающего функциональную активность Т-лимфоцитов [17].
 |
Целью настоящего исследования было изучение клеточного иммунитета у больных с различными формами КПЛ и влияния на него нового отечественного иммуномодулятора ликопида. Этот иммуномодулятор вызывает хороший клинический эффект при ряде заболевании, связанных с нарушениями иммунной системы [2], в частности, при некоторых аутоиммунных заболеваниях кожи [3].
Авторы: Ханухова Л.М., О.Ф. Рабинович,
Н.М. Голубева, К.Ф. Хамидуллина,
С.В. Климова, Б.В. Пинегин.
(ГНЦ — Институт иммунологии Минздрава РФ, ЦНИИ стоматологии Минздрава России, г.Москва)
В основную группу были включены 42 пациента с КПЛ — 32 женщины и 10 мужчин в возрасте от 20 до 60 лет. Продолжительность заболевания у них колебалась от 6 мес до 10 лет. Контрольную группу составили 42 здоровых донора в возрасте от 20 до 60 лет У всех больных исследовали иммунный статус по методологии, принятой в ГНЦ — Институте иммунологии Минздрава РФ [5]. Наиболее подробно методические подходы описаны Р. М. Хаитовым и соавт. [6].
Больные получали ликопид в таблетках (производство ЗАО «Пептек») по 10 мг 2 раза в день внутрь за 30−40 мин до еды в течение 10 дней. Перед началом и через 3−5 сут после окончания лечения у больных исследовали иммунологические показатели. Наблюдения за клиническим состоянием больных вели в течение 1 года.
Материалом для исследования служила периферическая кровь, взятая из кубитальной вены с гепарином (25 БД/мл). Использовали мононуклеары, выделенные из периферической крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла-пика, d=1,077 («Fannacia»).
Для определения популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов использовали набор моноклональных антител (МКАТ) «Simultest IMK-Lymphocytc» («Becton Dickinson»). Результаты учитывали с помощью проточного цитометра «FACSCalibur» («Becton Dickinson») по программе «Simulset» в специально составленной панели.
При постановке пролиферативного теста мононуклеары периферической крови культивировали в 96−луночных планшетах («Flow») в количестве 200 тыс. на лунку в полной ростовой среде (ПРС), состоящей из среды RPMI-1640 («Flow»). 10% инактиви-рованной эмбриональной телячьей сыворотки («Flow»), 10 мМ HEPES-буфера («Flow»). 2 мМ L-глутамина (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) и 50 мк/мл гентамицина («Pharmacium»). В опытные лунки добавляли ФГА («Serva») в дозе 10 мкг/мл или митоген лаконоса («Serva») в дозе 10 мкг/мл. В контрольные лунки вносили эквивалентное количество ПРС. Реакцию учитывали с помощью радиометрического метода с применением 3Н−тимидина в дозе 1 мкКи на жидкостном сцинтилляционном бета-счетчике («бета-Track»).
Для выявления раннего активационного маркера лимфоцитов CD69 мононуклеары, полученные по описанной выше методике, инкубировали в ПРС при 37град. С в течение 4 ч в присутствии ФГА в концентрации 10 мкг/мл. После инкубации определяли экспрессию маркера CD69 отдельно на лимфоцитах CD3+, CD3+CD4+ и CD3+CD8+, используя набор МКАТ «Fast Immune» («Becton Dickinson»). Определяли процент клеток, несущих маркер CD69, с помощью трехцветного цитометрического анализа в программе «Cell Quest» на проточном цитометре «FACSCalibur» («Becton Dickinson»).
Для выявления лимфоцитов, содержащих внутриклеточные цитокины, использовали методику Т. Yung и соавт. [23], которая заключается в следующем. В ПРС культивировали 100 мкл мононуклеаров в концентрации 2 млн клеток на 1 мл в 96−луночных плоскодонных планшетах («Nunc») с двумя поликлональными активаторами лимфоцитов — форбол-миристата ацетатом — ФМА («Sigma») в концентрации 10 нг/мл и иономицином в концентрации 1 мМ («Sigma») в присутствии 3 мкМ моненсина («Sigma»). Последний подавляет секрецию цитокинов и способствует их накоплению в клетке. Планшеты инкубировали при 37град. С в СО2−инкубаторе в течение 6 ч. После окончания инкубации клетки фиксировали 4% раствором параформальдегида («Sigma»), пермеабилизировали 0,l % раствором сапонина («Sigma») и окрашивали для определения иммунофенотипа клетки анти-СD3−МКАТ, меченными ФИТЦ, а для определения внутриклеточных цитокинов — анти-гамма-ИФН-МКАТ, меченными фикоэритрином (ФЭ) или анти-ИЛ-4−МКАТ, меченными ФЭ. Использовали МКАТ фирмы «Becton Dickinson». Определяли процент клеток, несущих поверхностный СD3−антиген (зеленое свечение), и среди них — процент клеток, содержащих в цитоплазме гамма-ИФН или ИЛ-4 (красное свечение) с помощью двухцветного анализа в программе «Cell Quest» на проточном лазерном цитометре «FACSCalibur» («Becton Dickinson»).
Для определения способности секретировать цитокины лимфоциты, выделенные по описанной выше методике, культивировали с ФГА («Serva») в дозе 10 мкг/мл в течение 24 ч. В супернатанте определяли цитокины с помощью двухцентрового иммуноферментного метода, используя набор фирмы R&D для определения гамма-ИФН и набор фирмы «Протеиновый контур» (СПБ) для определения ИЛ-4.
Результаты и обсуждение. При изучении популяционного состава было установлено, что содержание основных клеточных популяций лимфоцитов периферической крови больных КПЛ — Т-, В- и NK-клеток находилось в пределах нормы (табл. 1). В пределах нормы находились также и уровни активированных лимфоцитов — CD3−HLA-DR+ и CD3+HLA−DR+. В то же время у больных КПЛ наблюдалась отчетливая тенденция к повышению количества СD8+−клеток, которая в силу большого разброса данных не была статистически значимой.
Авторы: Ханухова Л.М., О.Ф. Рабинович,
Н.М. Голубева, К.Ф. Хамидуллина,
С.В. Климова, Б.В. Пинегин.
(ГНЦ — Институт иммунологии Минздрава РФ, ЦНИИ стоматологии Минздрава России, г.Москва)
Показатели клеточного иммунитета у больных КПЛ до и после лечения ликопидом
| Показатель | Норма | До лечения ликопидом | После лечения ликопидом |
| CD3+, % | 69 ± 1,3 | 63 ± 12 | 65 ± 13 |
| CD4+, % | 40 ± 0,9 | 41 ± 7 | 35 ± 12 |
| CD8+, % | 28 ± 0,9 | 37 ± 9 | 42,5 ± 11 |
| ИРИ | 1,5 ±0,12 | 1,2 ± 0,5 | 0,9 ± 0,3 |
| | 15,4 ± 2,6 | 18 ± 8 | 13 ± 4 |
| CD3+HLA−DR+, % | 6,6 ± 4,3 | 6,3 ± 5,4 | 12 ± 5,5 |
| CD3−CD16+CD56+ | 14,5 ± 4,1 | 18 ± 8 | 21 ± 11,5 |
| CD3+CD16+CD56+ | 4,7 ± 2,8 | 6.3 ± 5,4 | 8,4 ± 6,4 |
| CD19+ | 11,6 ± 4,1 | 11,2 ± 4 | 9,5 ± 5 |
| CD3+CD69+ | н.д. | 39,1 ± 12,8 | 50,5 ± 9,04** |
| CD3+CD4+CD69+ | 19,5 ± 1,7 | 21,05 ± 10,7 | 26,5 ± 10,1 |
| CD3+CD8+CD69+ | 22,6 ± 2,7 | 18,5 ± 6,6 | 27,7 ± 10,7** |
| Спонтанная пролиферация, имп/мин | 855 ± 501 | 895 ± 374 | 823 ± 412 |
| Пролиферативный ответ на ФГА, имп/мин | 47646 ± 15792 | 26 639 ± 21178* | 25339 ± 14289 |
| Пролиферативный ответ на митоген лаконоса, имп/мин | 11478 ± 3749 | 7740 ± 5395 | 6943 ± 3530 |
Примечание. Н.д. — не делали, ИРИ — иммунорегуляторный индекс. Одна звездочка — р < 0,05 между показателями в норме и у больных КПЛ, две звездочки — р < 0,01 между показателями до и после лечения.
Однако при таких формах заболевания, как эрозивно-язвенная и буллезная, характеризующихся особой тяжестью и остротой воспалительного процесса, различия по сравнению с контрольной группой были статистически значимыми (данные не представлены). Возможно, это повышение имеет отношение к этиопатогенезу заболевания. В настоящее время имеются данные о роли Т-лимфоцитов CD8+ в повреждении кожи при развитии в ней иммунопатологических процессов. Цитотоксические клетки CD8+ всегда присутствуют в псориатических бляшках, и при их персистенции не происходит разрешения патологического процесса. Повышенный уровень Т-клеток CD8+ наблюдается и в пораженных участках кожи при КПЛ [10].
При изучении пролиферативного ответа на ФГА было выявлено его снижение, что указывает на подавление функциональной активности Т-лимфоцитов (см. табл. 1). Наибольшее снижение этой активности происходило при язвенно-эрозивной форме, характеризующейся, как уже отмечалось, наибольшей остротой и тяжестью течении заболевания. Снижение пролиферативной активности лимфоцитов на Т-митогены выявляется при других аутоиммунных процессах, особенно при тех, в этиопатогенезе которых ведущая роль принадлежит Тh1−клеткам, — при рассеянном склерозе и ревматоидном артрите [1, 7].
При изучении активационного маркера CD69 на лимфоцитах больных КПЛ, стимулированных ФГА (см. табл. 1), установлено, что после лечения ликопидом происходило статистически значимое повышение его уровня на Т-лимфоцитах CD3+ и CD3+CD8+. Увеличение экспрессии CD69 наблюдалось также и на Т-лимфоцитах, CD3+CD4+, но оно не было статистически значимым.
Авторы: Ханухова Л.М., О.Ф. Рабинович,
Н.М. Голубева, К.Ф. Хамидуллина,
С.В. Климова, Б.В. Пинегин.
(ГНЦ — Институт иммунологии Минздрава РФ, ЦНИИ стоматологии Минздрава России, г.Москва)
При изучении цитокинсодержащих клеток, активированных ФМА и иономицином, установлено, что процент лимфоцитов, содержащих в цитоплазме ИЛ-4, был крайне низким и существенно не отличался от такового у здоровых доноров (табл. 2). Лечение ликопидом не изменяло процент клеток, содержащих этот цитокин. Противоположная картина наблюдалась при изучении гамма-ИФН-содержащих клеток. Оказалось, что процент лимфоцитов и СD3+−лимфоцитов, содержащих этот цитокин, статистически значимо был повышен у больных КПЛ (см. табл. 2). После проведенного лечения ликопидом процент гамма-ИФН-содержащих лимфоцитов снижался (р < 0,05). Процент СD3+−лимфоцитов, содержащих этот цитокин, также имел тенденцию к снижению (р < 0,1).
Цитокинсодержащие клетки в периферической крови больных КПЛ до и после лечения ликопидом
| Лимфоциты | Норма | До лечения ликопидом | После лечения ликопидом |
| ИЛ-4−содержашие | н.д. | 4,4 ± 5,8 | 6,1 ± 4,7 |
| | 1,3 ± 0,6 | 3,4 ± 4,5 | 5,3 ± 4,7 |
| Гамма-ИФН-содержащие | 8,4 ± 1,3 | 26,8 ± 6,5* | 21,5 ± 4,6** |
| | 6,7 ± 0,8 | 21,1 ± 5,9* | 17,0 ± 3,4*** |
Примечание. Н. д. — не делали. Одна звездочка — р < 0,05 между показателями в норме и у больных КПЛ; две звездочки — р < 0,05, три — р < 0,1 при сравнении показателей до и после лечения.
Авторы: Ханухова Л.М., О.Ф. Рабинович,
Н.М. Голубева, К.Ф. Хамидуллина,
С.В. Климова, Б.В. Пинегин.
(ГНЦ — Институт иммунологии Минздрава РФ, ЦНИИ стоматологии Минздрава России, г.Москва)
Синтез цитокинов мононуклеарами периферической крови больных КПЛ до и после лечения ликопидом
| Цитокин | Норма | До лечения ликопидом | После лечения ликопидом |
| | 87,5 ± 14,8 | 87,9 ± 46,03 | 155,4 ± 77,5* |
| | 35,5 ± 10,1 | 95,5 ± 61,2 | 102,7 ± 81,01 |
Примечание. Звездочка — р < 0,05 (различия между группами больных КПЛ до и после лечения).
Авторы: Ханухова Л.М., О.Ф. Рабинович,
Н.М. Голубева, К.Ф. Хамидуллина,
С.В. Климова, Б.В. Пинегин.
(ГНЦ — Институт иммунологии Минздрава РФ, ЦНИИ стоматологии Минздрава России, г.Москва)
При анализе клинической картины установлено, что практически у всех больных КПЛ наблюдался выраженный положительный эффект от лечения ликопидом. При экссудативно-гиперемической форме происходило резкое уменьшение гиперемии и отечности слизистой оболочки. При эрозивно-язвенной форме существенно сокращались размеры поражения, исчезали гиперемия и отечность. В 5 из 7 случаев происходила полная эпителизация эрозий. При буллезной форме наблюдались исчезновение пузырей и отсутствие их возникновения в течение 3 мес, что считается хорошим результатом лечения при этой форме заболевания. Положительный эффект отмечен и при лечении ликопидом гиперкератотической формы.
Как уже отмечалось, КПЛ можно отнести к заболеваниям, в этиопатогенезе которых ведущая роль принадлежит Тh1−лимфоцитам. В результате их активации происходит повышенный синтез цитокинов, вызывающих в коже воспалительный процесс типа гиперчувствительности замедленного типа. Ингибиторами Тh1−клеток являются ИЛ-4 и ИЛ-10, продуцируемые Th2−клеткам и [14] и относящиеся к разряду противовоспалительных цитокинов. В связи с этим положительный клинический эффект ликопида, вероятно, обусловлен его способностью повышать продукцию Тh2−клетками ИЛ-4 и снижать количество клеток, синтезирующих гамма-ИФН. Так, у больного В. (типичная форма заболевания) с отличным клиническим эффектом от применения ликопида уровень гамма-ИФН после лечения снизился со 137 до 14 МЕ/мл. У больной К. (экссудативно-гиперемическая форма) также с отличным клиническим эффектом процент лимфоцитов и СD3+−лимфоцитов, содержащих в цитоплазме гамма-ИФН, составил до лечения соответственно 29 и 22, после лечения — 20 и 15. Возможно, положительный клинический эффект ликопида связан с его способностью подавлять продукцию Thl-клетками и других провоспалительных цитокинов, в частности ФНО, играющего существенную роль в развитии воспалительной реакции при КПЛ [18]. Применение ликопида у больных рассеянным склерозом вызывало подавление синтеза мононуклеарами периферической крови этих больных ФНО, играющего важную роль в этиопатогенезе данного заболевания [4]
Положительный клинический эффект ликопида у больных КПЛ мог быть также связан с его нормализующим действием на функциональную активность лимфоцитов. У этих больных наблюдалось изменение функциональной активности Т-лимфоцитов, проявляющееся снижением пролиферации, индуцированной ФГА. Ликопид, не усиливая пролиферативный ответ лимфоцитов, повышал экспрессию на них раннего активационного антигена CD69. Предварительный анализ полученных результатов позволяет говорить о наличии связи между клиническим эффектом и интенсивностью экспрессии этого антигена. Так, у больной К. с отличным клиническим эффектом до лечения ликопидом содержание CD3+CD69+ составляло 35%, после лечения — 63%. Известно, что этот антиген действует как костимулятор в процессах активации и пролиферации Т-клеток [24]. Он имеет прямое отношение к активации генов, ответственных за синтез ИЛ-2. Сигналы, поступающие с CD69, повышают продукцию этого цитокина и экспрессию на клетках CD25 — рецептора для ИЛ-2 [131. Вероятно, повышение экспрессии CD69 под влиянием ликопида способствует нормализации функциональной активности лимфоцитов больных КПЛ, что также может быть одной из причин его положительного клинического эффекта.
Авторы: Ханухова Л.М., О.Ф. Рабинович,
Н.М. Голубева, К.Ф. Хамидуллина,
С.В. Климова, Б.В. Пинегин.
(ГНЦ — Институт иммунологии Минздрава РФ, ЦНИИ стоматологии Минздрава России, г.Москва)
1. У больных КПЛ наблюдалось подавление функциональной активности лимфоцитов периферической крови, проявляющееся их пониженной пролиферативной активностью в отношении Т-тимогена — ФГА, причем наибольшее снижение отмечено у больных с эрозивно-язвенной и буллезной формами заболевания, характеризующимися наибольшей тяжестью клинического течения и остротой воспалительной реакции.
2. Применение ликопида повышало экспрессию на CD3+ и СD3+СD3+−лимфоцитах периферической крови больных КПЛ раннего активациоиного антигена CD69, что могло быть отражением улучшения функционального состояния этих клеток.
3. У больных КПЛ в периферической крови повышен уровень лимфоцитов и СD3+−лимфоцитов, содержащих в цитоплазме провоспалительный цитокин гамма-ИФН. Применение ликопида вызывало значимое снижение количества лимфоцитов и СD3+−лимфоцитов, содержащих этот цитокин.
4. Применение ликопида повышало секрецию мононуклеарами периферической крови больных КПЛ противовоспалительного цитокина ИЛ-4.
5. Применение ликопида вызывало выраженный клинический эффект практически при всех формах КПЛ.
1. Гусев Е. И.. Демина Т. Л., Бойко А. Н. Рассеянный склероз. — М., 1997.
2. Иванов В. Т., Хаитов Р. М., Андронова Т. М., Пинегин Б. В. // Иммунология. — 1996. — No 2. — С. 4−6.
3. Короткий Н. Г., Шарова Н. М. // Актуальные вопросы дерматологии и венерологии. — СПб., 1994. — С. 64−65.
4. Пащенков М. В.. Бойко А. И., Пинегин Б. В. и др. // Человек и лекарство: Тезисы докладов 5−й Всерос. нац. конгресса. — М., 1998. — С. 164.
5. Петров Р. В., Хсштов Р. М., Пинегип Б. В. и др. // Иммунология. — 1992. — No 6. — С. 51−62.
6. Хаитов Р. М.. Пинегин Б. В., Истамов X. И. Экологическая иммунология. — М.. 1995.
7. Ярилина А. А., Ннконова М. Ф., Литвина М. М. и др. // Иммунология. — 1999. — No 3. — С. 51−55.
8. Andre J., Laporte М., Delavault P. // Acta stomat. belg. — 1990. — Vol. 87. — P. 229−231.
9. Areias J., Velho G. C., Cerqueira A. et al. // Eur. J. Gastroent. Hepatol. — 1996. — Vol. 8. — P. 325−828.
10. De Panfilis G.// Exp. Derm. — 1998. -Vol. 7. — P. 121−131.
11. Hildebrand A., Kolde G., Luger Т A.. Schwarz T. // J. Amer. Acad. Derm. — 1995. — Vol. 33. — P. 880−883.
12. Judich E. A., Maizels R. M. // Inmunol. Today. — 1997. — Vol. 18. — P. 387−391.
13. Lio D., Candore G., Cinga D. et al. // Mech. Ageing Develop. — 1996. — Vol. 31. — P. 51−58.
14. Romagnani S. // Clin. Immunol Immunopath. — 1996. — Vol. 80. — P. 225−235.
15. Shiozawa S., Morimoto I., Tanaka X., Shiozawa K. W. // Brit. J. Rheumv- 1992. — Vol. 31. — P. 405−408.
16. Sosroseno W., Herminajeng E., Goeno S. // Asian Рас Allergy Immunol. — 1994. — Vol. 12. — P. 161−168.
17. Su. M., Qian D. H., Chen Y. H. // Chung Kuo Yao Li Hsuch Pao. — 1991. — Vol. 12. — P. 378−380.
18. Sugerman P. В., Savage N. W., Seymour G. J., Walsh L. J. // J. oral Path. Med. — 1996. — Vol. 25 — P. 219−224.
19. Taylor H. G., Nixon N., Daves B.T. // Scand. J. Rheum. — 1993. — Vol. 22. — P. 280−284.
20. Welsh L. J., Savage N. W., Ishil Т., Seymour G. J. // J. oral Path. Med. — 1990. — Vol. 19. — P. 389−396.
21. Yamomoto Т., Osaki T., Yoneda K., Ueta E. // Ibid. — 1994. — Vol. 23. — P. 309−315.
22. Yamomoto Т., Osaki T. //J. invest. Derm. — 1995. — Vol. 104. — P. 784−788.
23. Yung Т., Schauer U., Heuser C. et. al. // J. immunol. Meth. — 1993. — Vol. 159. — P. 197−207.
24. Ziegler S. F., Ramsdell F., Anderson M. R. // Stem Cells. — 1994. — Vol. 12. — P. 456−465
Журнал «ИММУНОЛОГИЯ», № 5, 1999
Смотри также
24 октября 2002 | 12:10
Стоматология в Удмуртии. Стоматологическому факультету Ижевской государственной медицинской академии 20 лет.
В Удмуртии подготовка зубоврачебных кадров началась в 1941 году при фельдшерско-акушерской школе. Первый выпуск состоялся в марте 1943 года. Стоматологи в республику направлялись в основном из Пермского, Казанского институтов. В 70-х годах в Удмуртию прибыли выпускники институтов в Калинине и Москве. В январе 1976 года в Ижевске было 208 врачей, из них 43 стоматолога (20%).
22 октября 2002 | 01:10
Некоторые особенности дентальной имплантации.
Стремительное развитие дентальной имплантации в России продвигает использование имплантатов в повседневную стоматологическую практику. За годы применения имплантатов были проведены
10 октября 2002 | 17:10
Опыт проведения реконструктивных операций на пародонте у больных сахарным диабетом
По данным ВОЗ, ежегодный прирост числа больных сахарным диабетом составляет 0,05% и их общее количество приближается к 1,6 млн во всем мире. В России уровень заболеваемости диабетом составляет около 7,56%.
У больных сахарным диабетом отмечается высокая степень распространенности воспалительных заболеваний пародонта.
10 октября 2002 | 17:10
Знакомимся с лазерами фирмы BIOLASE Technology, Inc. (США)
В Москве в Клинике TBI-Company состоялась встреча врачей-стоматологов с Dr. Wolfgang Richer, Dusseldorf. Тема встречи — опыт использования лазерных технологий в cтоматологии, принципы работы лазеров и особенности лечебного воздействия на ткани, лазеры фирмы BIOLASE.
10 октября 2002 | 16:10
Композиты нового поколения
В Московском государственном медико-стоматологическом университете 6 и 7 июля 2002 г. прошло яркое событие, которое собрало множество участников (более 300 человек) — профессоров и преподавателей, студентов, ординаторов, аспирантов, зубные техников, приглашенных стоматологов (ортопедов, терапевтов, гигиенистов, зубных техников).
