30 мая 2003 13:43 |
Применение трепонемных магнитных иммуносорбентов в иммуноферментном анализе для диагностики сифилиса.
Применение иммуносорбционных методов на основе иммобилизированных антигенов и антител является в последние годы одним из перспективных направлений в создании новых диагностических препаратов. Преимущества перед общепринятыми методами появились с началом применения сорбентов с магнитными свойствами, которые используются в качестве твердой фазы для селективного концентрирования на их поверхности различных биологически активных агентов: корпускулярных и водорастворимых антигенов различных микроорганизмов, вирусов, иммуноглобулинов.
Целью настоящих исследований явилась разработка биотехнологии изготовления иммобилизированных гранулированных трепонемных антигенных препаратов с магнитными свойствами для иммунодиагностики сифилиса. Используя опыт иммунодиагностики диффузных болезней соединительной ткани (системной склеродермии, ревматоидного артрита, системной красной волчанки) с применением иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами, мы начали свои исследования с разработки трепонемных антигенных полиакриламидных магноиммуносор-бентов (МИС). Для их получения использовали микрогранулированный полиакриламидный носитель, полученный методом эмульсионной полимеризации с включенным в него магнитным материалом. Белковым лигандом служил коммерческий «ультра озвученный» трепонемный антиген (УЗТА), иммобилизацию которого проводили путем ковалентного присоединения с использованием глутарового альдегида.
Результаты, полученные при исследовании сывороток крови больных различными формами сифилиса до, в процессе и по окончании лечения в иммуноферментном анализе с использованием полиакриламидных трепонемных МИС, несомненно, представляли интерес и свидетельствовали об усовершенствовании иммунодиагностики сифилиса.
Однако опыт экспериментального освоения данных диагностикумов показал, что их недостатками являлись длительность и многостадийность получения, использование дорогостоящих импортных, высокотоксичных реактивов.
С целью разработки сорбционного материала, обладающего стандартностью состава и структурных характеристик, повышения специфической емкости и чувствительности, упрощения способа получения магноиммуносорбента, мы, используя принципы получения биотехнологических МИС на основе органо-кремнеземного магносорбента — алюмосиликата, впервые предложили технологию получения трепонемных антигенных композиционных МИС на основе кремнезема (Треп-КМИС).
Синтез кремнеземных носителей позволял получать сорбенты, которым присущи положительные свойства неорганических матриц: химическая чистота, гидрофильность, отсутствие набухаемости в растворах, значительная адсорбционная емкость, отсутствие токсичности, жесткость остова, микробиологическая устойчивость.
Способ получения КМИС заключался в следующем: смесь, состоящую из 2,5 г алюмоселикатного наполнителя и 0,5 г магнитного порошка, суспендировали в 40 г 0,2—0,4% водного раствора полиглюкина и далее выдерживали при комнатной температуре 1 ч. Полученный сорбент высушивали при 100—110°С в течение 30 мин. К 1 г полученного препарата добавляли 12 мл 23% раствора хлорида натрия и 1 мл вторичного алкилсульфата натрия. Смесь инкубировали 1—2 ч при температуре 37°С, затем сорбент отмывали 100 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 100 мл дистиллированной воды. К 0,1 г активированного сорбента приливали 1 мл УЗТА с содержанием белка 3,5 мг/мл. Смесь оставляли при 37°С в течение 1 ч. Далее надосадочную жидкость удаляли, а носитель промывали 0,9% раствором хлорида натрия до «О» экстинкции на спектрофотометре.
Полученные композиционные алюмосиликатные МИС представляли собой высокодисперсные микрогранулы неправильной формы с ярко выраженными магнитными свойствами, обладающие хорошей смачиваемостью и эффективным оседанием в растворе, отсутствием склонности к конгломерации. Сорбенты имели размеры гранул от 20 до 100 мкм. Среднее значение их удельной поверхности 117 м/г, средний радиус пор 35 нм, объем пор 1,7 см/г.
Для проведения иммуноферментного анализа (ИФА) во флаконы (типа пенициллиновых) вносили по 0,1 мл 10% взвеси Треп-КМИС. Затем в опытные флаконы вносили по 0,2 мл исследуемых сывороток, во флаконы с отрицательным контролем — 0,2 мл фосфатно-солевого буферного раствора, во флаконы с положительным контролем — 0,2 мл положительно реагирующей сыворотки. Через 20—30 мин инкубации при температуре 37°С после тщательной промывки гранул сорбента с помощью постоянного магнита во все флаконы (опытные и контрольные) вносили по 0,2 мл конъюгата иммунопероксидазного против глобулинов человека в рабочем разведении. Через 20—30 мин после отмывки гранул во флаконы вносили по 0,2 мл субстрат-индикаторного раствора (0,1 М лимонная кислота с 0,2 М натрием фосфорнокислым в присутствии 0,006% перекиси водорода). Реакцию останавливали внесением во флаконы 0,2 мл 2 М серной кислоты. Учет результатов проводили визуально через 1—5 мин. При положительном результате происходило оранжево-коричневое окрашивание, при отрицательном — раствор ингредиентов реакции оставался бесцветным. Для учета результатов на анализаторе колориметрическом «Мультискан» содержимое флаконов после остановки реакции переносили в микропланшеты и снимали показания прибора при 492 нм. Положительными считали пробы, показатели, цвета которых превышали контрольные в 1,5 раза и более.
Таким образом, МИС при контакте со специфическими антителами осуществляли динамическое, селективное их концентрирование, образуя иммунный комплекс, в дальнейшем определяемый с помощью пероксидазной реакции.
Сравнительную оценку эффективности и чувствительности разработанной тест-системы проводили с 539 сыворотками крови больных различными формами сифилиса: до лечения, в процессе и по окончании его. Треп-КМИС при серодиагностике сифилиса в ИФА на 0,9% выше по полному расхождению результатов и на 2,3% — по степени позитивности теста по сравнению с УЗТА в реакции связывания комплемента (РСК). В том числе при первичном серонегативном сифилисе полное расхождение результатов в пользу Треп-КМИС составило 8,3% случаев, при первичном серопозитивном сифилисе — 1,8% случаев.
При исследовании 230 сывороток больных сифилисом в процессе и по окончании лечения удалось установить, что позитивность теста при использовании Треп-КМИС в ИФА выше на 4,3% случаев по сравнению с РСК и на 1,7% выше по полному расхождению результатов. Контрольной группой служили сыворотки крови 209 лиц, свободных от сифилитической инфекции. Установлена специфичность теста 99,7%, в то время как исследуемые сыворотки в PC К с УЗТА были специфичны в 99,2% случаев.
Таким образом, нами разработана магноиммуносорбентная тест-система для диагностики сифилиса в ИФА, испытание диагностической ценности которой свидетельствует о ее информативности, высокой чувствительности, специфичности, надежности и перспективности практического применения.
Смотри также
18 июня 2003 | 13:06
Тактика лечения урогенитального хламидиоза у больных с патологией пищеварительной системы
Урогенитальный хламидиоз (УГХ) — одно из самых распространенных заболеваний, передаваемых половым путем. По имеющимся данным, ежегодно в мире регистрируется около 90 млн. новых случаев заражения Chlamydia trachomatis. Статистика свидетельствует, что среди сексуально активной возрастной группы УГХ страдает около 40% мужчин и 35% женщин.
19 мая 2003 | 15:05
Серологическая диагностика сифилиса
Серодиагностика применяется для подтверждения клинического диагноза сифилиса, постановки диагноза скрытого сифилиса, контроля за эффективностью лечения и как один из критериев излеченности больных сифилисом профилактического обследования определенных групп населения.
16 мая 2003 | 16:05
Роль облигатной анаэробной флоры у женщин с инфекционными урогенитальными заболеваниями
Современная патология человека характеризуется изменением этиологической структуры инфекционных заболеваний, снижением удельного веса инфекций, вызываемых традиционными патогенами и возрастанием роли условно-патогенных и оппортунистических микроорганизмов.
05 мая 2003 | 14:05
Сифилис желудка
Понятие "сифилис желудка" является более собирательным, чем нозологическим, так как объединяет разнообразные клинико-морфологические проявления: от гастропатии при вторичном до язвенно-гуммозных поражений при третичном сифилисе. Диагноз сифилитического поражения желудка обычно ставится на основании данных клинико-лабораторных и патогистологических исследований.
14 апреля 2003 | 10:04
Применение полижинакса в комплексной терапии инфекций, передаваемых половым путем, у женщин
После того как Левенгук в конце XVII века изобрел микроскоп, было доказано, что здоровый человек является хозяином стабильной популяции микроорганизмов. В 1895 г. Додерлейн при микроскопии мазков из влагалища впервые обнаружил грамположительные палочки (называемые в настоящее время лактобактериями) и опубликовал классический материал о микробной флоре влагалища. По мере того как развивалась таксономия микроорганизмов и в диагностику внедрялись бактериологические среды, накапливалось все больше сведений о составе микрофлоры влагалища.
